Gli effetti della guerra greco-gotica (535-553 d.C.) furono particolarmente gravosi per la città di Chiusi ed interessarono anche la primitiva cattedrale, spingendo il locale vescovo Florentinus, noto esclusivamente da una lettera a lui indirizzata da Papa Pelagio (558-560 d.C.), a deciderne una radicale ricostruzione, attorno al 560 d.C., come ricordato da una iscrizione presente sul pulvino marmoreo della terza colonna di sinistra. L’impianto generale del sacro edificio risale proprio a questa fase costruttiva di cui è espressione mirabile il colonnato centrale, con la serie di diciotto colonne di epoca romana, alcune in travertino, la maggior parte in marmi pregiati (marmo bianco pario, verde cipollino, breccia portoghese e granito egiziano), provenienti da edifici dell’antica Clusium. Nove capitelli antichi sono sormontati da altrettanti pulvini decorati con immagini tratte dal repertorio figurativo della più antica arte cristiana. Realizzati attorno alla metà del VI secolo d.C., sono tuttora considerati come il più cospicuo ciclo di rilievi della Tarda Antichità in Toscana.